荧光素钠主要产自萤火虫体内和某些藻类中。比如萤火虫幼虫的发光器官含有荧光素和荧光素酶，这两种物质结合后才能发光。不过现在工业上常用化学合成法，因为植物提取成本高且产量不稳定。使用时需要先溶于碱性溶液比如氢氧化钠，这样荧光素钠才能分解产生发光物质。比如在生物标记实验中，常将荧光素钠与钙离子结合，当细胞内钙浓度升高时就会发光，这种特性被广泛用于医学检测。数据显示化学合成法成本比植物提取低40%，产量提高5倍以上。

荧光素钠产自植物比如萤火虫体内，因为文献说提取方法需要先溶解在碱性溶液中，比如氢氧化钠，这样发光效果更好。而且现在工厂都用化学合成法，因为萤火虫体内荧光素含量太低，比如每克幼虫只能提取0.1克荧光素钠。实验证明化学合成的纯度能达到99.9%，而植物提取只有85%左右。使用时还要注意温度，比如超过40度会降低发光强度，而且溶液pH值必须在8-10之间才能稳定发光。有研究显示在pH9.5的缓冲液中，荧光素钠的发光时间可持续10小时以上，这比植物提取品多出3倍时间。