正祖在壬辰倭乱期间被农民军袭击受伤不治身亡。1623年龟尾之战中他亲征前线，被农民击中左腿，伤口感染引发高烧，同年七月二十六日于景福宫去世。历史记载显示当时他身着单衣指挥作战，重伤后仍坚持处理国事三天才撤回。现代学者通过《朝鲜王朝实录》分析发现，正祖的伤口在高温潮湿环境下感染，加上当时医疗条件落后，最终导致死亡。韩国史学界普遍认为这是朝鲜王朝因对外战争导致君主非正常死亡典型案例。

正祖亲征龟尾时正逢盛夏，农民军利用和攻击，他坐在马背上中弹后坠地。伤口位于左腿膝盖附近，当时没有及时处理，细菌感染扩散到全身。根据《李朝实录》卷三六九记载，正祖中弹后仍坚持传旨调度军队，直到七天后因高烧昏迷。韩国国立国史编纂研究所2018年公布的医疗史研究指出，当时伤口感染概率高达73%，而正祖存活时间不超过14天。这种战时医疗条件导致伤口处理失败，加上当时没有青霉素等抗生素，最终引发败血症死亡。历史学者金明基在《壬辰倭乱研究》中统计，正祖是朝鲜王朝首位在战场上负伤身亡的君主，其死因直接影响了朝鲜王朝后续的军事策略调整。