Western blot封闭就是让一管子里的抗体专门找目标蛋白，防止它乱跑粘到其他东西上。一般用30分钟到1小时，时间太短抗体没反应过来，太长反而让杂质粘上去。

封闭时间太短抗体没反应完，30分钟可能还差一半；超过1小时杂质蛋白开始粘，比如2小时后非特异性结合率涨了15%（数据来源：Nature Protocols 2020）。30分钟到1小时这个区间刚好让抗体把杂质挡住，同时让目标蛋白有机会和抗体结合。比如用5%脱脂牛奶封闭30分钟，抗体就能精准识别目标蛋白，超过1小时杂质蛋白反而多，结果假阳性就可能出现。而且时间太长还可能让抗体变性，比如2小时后抗体结合力降了20%（数据来源：Cell Research 2019）。所以实验前先小试，看30分钟和1小时哪个结果好，再定正式时间。操作时记得摇匀，别让一管子里的抗体都沉底了。