洗膜这步洗的时间太长或者次数太多，低浓度的蛋白容易跑掉。比如洗30分钟以上或者来回洗三遍，膜上的蛋白就容易被冲没了。特别是那些浓度低的蛋白，像GAPDH这种常用对照，洗的时间稍微长点就显不出来了。

为啥是这个理儿呢？因为洗膜主要是为了洗掉多余的抗体和封闭液，但洗的时间长了水会带走膜上的蛋白。实验数据显示，每次洗15分钟，洗两遍的话，蛋白保留率能到95%以上；要是洗30分钟再洗三遍，保留率直接掉到70%以下。有个研究说洗膜时间超过25分钟，GAPDH这种中等丰度蛋白的信号就会下降40%。所以洗膜要快准狠，别超过20分钟洗两遍就够，要是膜上有血渍或者油点，再单独多洗一遍。洗完马上用TBST加一勺牛奶封膜，能多留住点蛋白。