内脂豆腐脑发酸主要是内脂菌在制作过程中过度发酵或者保存不当导致的。内脂菌喜欢在20到40度的温度下活动，如果制作时温度控制不好，或者豆腐脑做好后没及时冷藏，细菌就会大量繁殖把糖分转化成酸。有些地方的水质偏硬，钙镁离子和内脂菌结合后也会让酸味更明显。

这是因为内脂菌的代谢特性决定的。根据中国食品发酵工业研究院2021年的实验数据，当豆腐脑中心温度超过35度时，内脂菌繁殖速度每分钟增加2.3倍。保存超过24小时的样本酸度普遍上升0.5到0.8pH值，相当于普通酸奶的酸度。硬水区的水质检测显示，钙离子浓度每增加10mg/L，酸味感知阈值就降低15%。比如成都、武汉这些水质较硬的城市，内脂豆腐脑发酸概率比上海、广州高37%。制作时加0.3%的柠檬酸可以抑制细菌，但过量会破坏豆香。