纸层析是分配层析的一种。操作分三步：1. 将滤纸浸泡在固定相（水）中，2. 滤纸平铺固定，样品点在固定相一侧，3. 用流动相（有机溶剂）从另一侧流过，分离成分层。

因为纸层析的固定相是水，流动相是像乙醇、丙酮这样的有机溶剂，所以它属于分配层析。实验证明，不同物质在水和溶剂中的溶解度差异，导致它们在滤纸上移动的速度不同，这样就能分出层。比如苯和氯仿在滤纸上移动距离差约5厘米，而丙酮和乙醇的差才2厘米。固定相的亲水性让水分子均匀铺开，样品点渗透后，溶剂从下往上爬，物质跟着溶剂跑，跑得快的先到溶剂侧，跑得慢的留在水侧，层层叠叠就分开了。