底物水平磷酸化就是细胞质基质里直接从糖分子身上拿能量给ATP的过程。糖分子在分解的时候，会先变成1,3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸这两种中间产物，这两种东西自带能量，能直接把能量传给ADP合成ATP。就像煮面时往水里加酵母，酵母自己会分解产生二氧化碳和能量，底物水平磷酸化就是这个原理，直接从糖分子中间产物身上拿能量。

糖酵解分两个阶段拿能量，底物水平磷酸化是其中一个阶段。在糖酵解的第七步和第十步，1,3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸分别把能量传给ADP，生成ATP。根据《生物化学原理》第5版数据，每个三碳糖生成1分子ATP，两个三碳糖总共生成2分子ATP。为什么选这两个中间产物当底物？因为它们分解时自带高能磷酸键，就像糖块捏成小团更容易捏碎，直接拿能量比慢慢分解更高效。研究显示，底物水平磷酸化产生的ATP占总量的2/6，虽然比例不高，但这是最直接的能量获取方式。就像用锤子直接砸钉子，不用先磨锤子，这就是底物水平磷酸化的优势。