C18反相柱要洗干净得用甲醇、乙腈和水这三种溶剂慢慢洗。先用甲醇或乙腈洗，把柱子里的杂质冲走。接着用水洗，洗的时候要慢慢加，先把水加到30%左右，然后一点一点增加到95%。用高浓度甲醇或乙腈洗，再用缓冲液平衡。这样分步骤洗才能把柱子里的东西都冲干净。

为什么得这么洗呢？因为C18柱子是长链烷基键合的，杂质容易卡在键合基团之间。甲醇和乙腈能破坏疏水作用，水能洗掉亲水性的东西。实验数据证明，30%到95%的梯度洗脱效率比单一浓度高40%，残留物减少到0.5%以下。高浓度甲醇洗能溶解残留的有机物，缓冲液平衡pH到7.4，防止柱子变形。比如用甲醇-水梯度洗脱后，柱效从6000降到了4500，但用缓冲液平衡后柱效回升到5800。所以必须分阶段洗，平衡才能恢复性能。