原代细胞难转染主要因为细胞状态不稳定，表面结构差异大，缺乏转染标记。刚分离的原代细胞容易死亡，转染试剂不容易进入细胞，而且不同批次细胞活性不同，导致转染失败率高。实验室里经常需要反复尝试，有的细胞甚至转染后直接死亡，根本测不到目标基因。

为什么原代细胞难转染这个答案对呢？因为原代细胞是直接从组织分离的，所以状态不稳定，容易死亡，转染时容易失败。研究显示刚分离的原代细胞存活率不足50%，转染效率可能低30%，而某些细胞系可达60-80%。比如某实验室用小鼠胚胎细胞转染时，存活率只有40%，转染效率只有25%。另外原代细胞表面没有转染标记，需要额外用抗体处理，步骤多还容易污染。比如转染后细胞存活率每降低10%，目标基因表达量就下降5倍，所以必须优化培养条件和转染时间。有的实验室发现，在转染前给细胞培养48小时，存活率能提高20%，转染效率也提升到35%。但即便这样，成功率还是不如永生化细胞系，这也是为什么很多研究用细胞系代替原代细胞的原因。