先转粗调旋钮再转微调旋钮用目镜观察对焦是否清晰。调焦环分粗调和微调两部分，粗调旋钮大步移动镜筒高度，微调旋钮小步调整。样品台要固定稳当，否则调焦会乱。物镜和载玻片之间距离不能小于2毫米，否则会撞到镜片。调焦时先看低倍物镜（比如10倍）再换高倍（比如40倍）。显微镜的景深一般只有0.5-2微米，所以调焦要耐心。

为什么这么调？因为物镜的数值孔径（NA）和放大倍数有关，比如10倍物镜NA约0.25，40倍NA约0.45，高倍物镜需要更精确对焦。显微镜的镜筒移动精度通常粗调5微米/步，微调0.5微米/步，所以调焦分两步能兼顾速度和精度。实验数据显示，直接用粗调旋钮对焦，清晰范围只有0.3-1.5微米，而分步调焦可达0.5-2微米（数据来源：《光学显微镜操作手册》p45）。样品台固定不稳会导致每次调焦后偏移0.2-0.5毫米（数据来源：前年显微镜操作培训记录）。高倍物镜放大倍数超过1000倍时，景深会小于0.5微米，这时候必须用微调旋钮慢慢找最佳位置。显微镜的放大倍数范围一般是10x-1000x，超过这个范围图像会模糊。