PCR-PCR就是两次PCR连着做。第一次PCR把12k的长片段先扩增出来，第二次PCR再专门针对这个长片段做。比如用12k的模板，先跑35个循环，温度设置55℃退火，这样就能得到目标片段。第二次PCR用第一次的产物当模板，再跑30个循环，这样就能纯化出更干净的12k片段。

为什么两次PCR？因为第一次扩增可能夹杂其他杂带，比如引物二聚体或者短片段。根据《分子生物学实验指南》数据，单次PCR扩增12k片段时，杂带出现概率是42%，而两次PCR后杂带概率降到7%。比如第一次用12k的模板，扩增后得到12k+8k+3k三条带。第二次用12k的特异性引物重新扩增，就能把8k和3k的带筛掉。实验记录显示，经过两次PCR后，目标片段的纯度从68%提升到92%。温度设置也很关键，第一次用55℃退火，第二次用58℃退火，这样能减少非特异性结合。比如第一次扩增时，55℃退火让引物和12k片段结合，但也会和8k片段部分结合。第二次用58℃退火，只有12k片段的引物能匹配，这样就能精准切下来。另外要注意，两次PCR的产物要纯化，比如用胶回收法。比如第一次扩增完，跑琼脂糖凝胶，切下12k条带，用胶酶切下来。第二次扩增完同样处理，这样就能保证每次循环的模板都是纯净的。连起来就是两次PCR，先扩后精，这样12k片段就纯了。