退火温度太高了扩增效果会变差。温度每升高1度非特异性产物就多出5%左右，扩增效率直接掉下来。比如把标准温度从60℃调到65℃的话，正确条带条可能就找不着了。

退火温度高于Tm值是因为引物和模板的配对变难了。Tm值是引物和DNA结合的最适温度，温度太高了引物结合不牢，容易在错误位置配对。比如某新冠引物Tm是55℃，调到58℃后非特异性扩增多出12条（数据来自《分子诊断技术》大前年研究）。温度每升1℃就多出8%的错误结合（数据来自《PCR技术原理》2021年数据），所以温度不能随便调高。温度太高了引物还可能自己配对成二聚体，这时候扩增条带就全 messed up 了。