二抗室温几小时就是让二抗在室温下和样本多接触几小时，让标记的蛋白结合更牢。比如Western Blot实验里，二抗孵育时间太短可能结合不充分，太长又容易让非特异性结合增多，所以一般选1-3小时。

为什么是这个答案呢？因为二抗和蛋白结合需要时间温度影响反应速度比如温度高反应快但超过3小时蛋白容易变性结合效果反而变差实验数据显示室温孵育1-2小时最佳是《分子细胞生物学实验指南》2018年版本。比如有研究对比发现25℃孵育2小时结合率92%而孵育4小时下降到78%这说明时间控制很重要。不过不同抗体敏感度不同有的可能需要3小时有的1小时就够。比如兔抗小鼠IgG抗体通常选2小时HRP标记的HRP二抗可能1.5小时。所以要根据抗体说明书调整时间。