调焦环顺时针转，物镜转到低倍镜，微调旋钮对准十字准线，载物台慢慢抬升，直到模糊变清晰。先看目镜里的图像，如果像撒芝麻一样，说明物镜离样本太近，需要调焦环往回退半圈；如果像雾蒙蒙的，说明物镜离样本太远，得往前进半圈。调焦时手要稳，别抖，载物台每次只抬1毫米，抬完再观察，直到十字准线和样本边缘同时清晰。

因为低倍镜的景深更大，所以更容易找到焦点，而高倍镜的景深只有0.1毫米，相当于头发丝的1/10，这时候必须精确对焦，否则就会模糊。根据显微镜原理，放大倍数每增加10倍，物镜焦距就减少1毫米，比如10倍物镜焦距1毫米，40倍物镜焦距0.25毫米，所以调焦时要先低倍再高倍。实验数据显示，当物镜从40倍换到100倍时，景深从0.02毫米缩小到0.005毫米，这时候必须用微调旋钮调整0.01毫米才能看清细节。比如用40倍物镜时，载物台抬1毫米相当于物镜前移1毫米，而换到100倍后，抬1毫米相当于物镜前移0.1毫米，所以调焦速度要减慢10倍。