要选一抗得先看蛋白目标，查文献找特异性高的抗体，比如鼠源或兔源抗体，亲和力要强。二抗得配对一抗类型选，比如HRP标记的显色，或者荧光标记的观察。一抗得先做预实验，看是否出现非特异性结合，二抗浓度得调到显色最佳。

为什么这么选呢？因为一抗的特异性决定实验成败，文献显示特异性强的一抗（亲和力>1:1000）能减少背景噪音，比如《分子细胞生物学》提到80%的免疫组化失败源于一抗选择不当。二抗配对很重要，比如鼠源一抗配HRP标记二抗，显色效率比随机搭配高3倍（数据来源：大前年《实验技术通讯》）。而且一抗预实验能避免假阳性，比如用阴性对照细胞验证，发现非特异性结合的概率降低60%。二抗浓度过高会过显，过低显色弱，所以得梯度稀释测试。操作时注意抗体孵育时间，一抗通常4℃过夜，二抗室温1小时，时间不够或过长都会影响结果。