首先提取细胞里的RNA然后用逆转录酶把RNA转成DNA接着把DNA片段连到载体上建个库。比如从人类细胞里提取mRNA用逆转录酶合成cDNA装进试管形成文库。

因为真核生物的RNA里有内含子干扰实验所以必须用mRNA而不是总RNA。数据显示人类基因组里内含子占70%左右直接逆转录总RNA会得到含内含子的错误DNA。比如用末端转移酶给cDNA加保护尾就能提高文库质量实验证明这样建库的效率比普通方法高3倍。比如2020年《自然》论文里说用逆转录法建cDNA文库成功获得10^6条高质量条目的案例。因为mRNA只携带外显子信息所以建出来的文库能精准研究基因表达。比如用这个方法科学家发现人类肝脏细胞里有5000多个基因在活跃表达而普通文库会包含大量无效条目。