首先得选抗体，看抗体和目标蛋白有没有结合，有没有被其他物质干扰，比如别选和细胞膜结合的抗体，否则标记后细胞膜会亮，看不准。接着得确定标记步骤，先标记一色，等颜色固定了再标记另一色，颜色混在一起会看错。上机前得调好机器，让不同颜色能分开看清楚。

为啥得这么干呢？因为抗体选错直接废实验，比如有人用抗CD3抗体去测B细胞，结果全显示阳性，实际只有5%的B细胞有CD3，数据全乱套了。有研究说正确选抗体能让结果准确率从60%提到92%，标记步骤顺序错的话，两色信号会重叠，比如标记CD4和CD8都用红色荧光，机器分不清哪个是哪个。上机前调机器就像调自行车刹车，不调好骑起来容易翻车。而且先标记一色再另一色，颜色不会互相染花，就像先穿蓝袜子再穿红袜子，不会把两种颜色混在一起。