加酸让半胱氨酸变稳，胱氨酸变松，柱子分得开。半胱氨酸在酸性里会带电，胱氨酸带电少，HPLC柱子认得清。比如用pH3的缓冲液洗，半胱氨酸跑得慢，胱氨酸跑得快，这样流出来先后顺序不同。文献说这样操作分离度能到1.8以上。

因为半胱氨酸有个巯基，在酸性条件下会质子化带负电，而胱氨酸两个巯基结合成二硫键，带电少。数据表明半胱氨酸pKa是8.3，胱氨酸pI是5.6，所以在pH3时半胱氨酸带负电，胱氨酸带正电。比如半胱氨酸在pH3时带负电，胱氨酸带正电，这样它们在柱子里的移动速度不同，分开了。文献说这样操作分离度能到1.8以上。加酸处理让半胱氨酸稳定，胱氨酸放松，这样HPLC就能分开了。比如半胱氨酸在pH3的缓释液中跑得慢，胱氨酸跑得快，这样流出来先后顺序不同。