WB实验先找对抗体最重要，选错抗体全白干。比如查文献看别人用哪个抗体，比如抗GAPDH的常用作内参。裂解细胞用RIPA缓冲液，加PMSF防蛋白酶。转膜选PVDF膜，用转膜仪压30分钟。一抗用4℃孵育过夜，第二天换TBST洗3次。封闭液用5%脱脂牛奶，二抗选HRP标记的，显影用ECL试剂。注意抗体浓度别太高，1:1000到1:5000合适，太高会假阳性。转膜时间别少于30分钟，否则蛋白跑不上去。显影时间别太长，灰度值太高会糊成一片。

为什么这么干？因为抗体选错直接废实验。有研究说用错抗体假阴性率高达40%，比如兔抗人抗体测小鼠蛋白就测不出来。封闭液用脱脂牛奶比BSA好，牛奶蛋白多封闭更牢，文献显示脱脂牛奶封闭效率高30%。转膜时间超过1小时反而让蛋白掉下来，30分钟足够让膜吸饱抗体。显影时间控制严格，超过5分钟信号会饱和，用X光片看灰度值最佳。比如某实验室用1:2000稀释抗体，转膜30分钟，封闭1小时，显影3分钟，结果准确率提升到92%。