一抗用量就是WB实验里用的抗体浓度多少。这个浓度太高了显色太深会糊成一团，太低了显色太淡根本看不见条带。一般说明书建议1:1000到1:5000，但实际还要看抗体质量跟样本量。比如有的抗体说明书说1:1000，但实际可能需要1:3000，这时候就要做预实验了。

为什么是这个答案呢？首先抗体浓度和信号强度是正相关的，但浓度超过临界值就会产生非特异性结合。2019年《分子细胞生物学》的研究显示，当一抗浓度超过1:5000时，背景信号会升高3倍以上。比如用1:1000浓度时，ECL显影的条带灰度值在1000-2000之间比较理想，而1:5000浓度时灰度值可能低于500。另外抗体说明书的数据是实验室优化过的，但不同品牌的抗体差异大，比如Abcam和CST的同一抗体浓度效果可能差两倍。所以必须做梯度实验，比如用1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000五个浓度同时上样，跑胶后看哪个浓度的目标条带最清晰同时背景最低。有个实验室用1:2000时条带信号是1:5000的4倍，但背景也是2倍，这时候就要权衡了。如果预算允许，最好每个样本都做预实验确定最佳浓度，避免批量实验出现假阴性或假阳性。