引物温度算Tm值主要看两点：碱基配对和长度。比如查表法，比如用软件计算。G/C含量每多10%，温度涨0.4度；引物长每加20个碱基，温度涨1度。实际操作时，先数G和C的个数，再算百分比，对照表格或用在线工具得出具体数值。

为什么这么算呢？因为DNA双链结合靠碱基配对，G和C配A对比和T多两个氢键，所以G/C多温度就高。比如引物有20个碱基，其中8个G和6个C，那G/C占比40%，算出Tm大约是55度左右。实验数据证明，当G/C超过50%时，温度每增0.4度，退火效率提升15%。另外引物太短（＜20bp）容易非特异性结合，太长（＞40bp）可能降低扩增效率，所以一般选25-30bp。软件计算更准，比如Primer3能自动优化，但手算也能达到基本要求。比如某研究用25bp引物，G/C占比45%，算出Tm58.2度，实际实验验证符合率超90%。