准备好样本就要把抗体包被在板子上了，洗板三遍去掉没结合的，加酶标液让蛋白和酶反应，测光看颜色深浅算浓度。洗板次数少的话假阳性会多，酶标液浓度太高会烧杯底。

因为抗体和蛋白结合需要时间，洗板少残留物会影响结果，比如用三次洗板抗体结合率能到95%以上。酶标液浓度一般在0.01-0.1mg/mL之间，超过0.1会明显烧杯底。测光时要调到450nm波长，吸光度超过3.0就说明蛋白浓度太高了。比如洗板四次的话非特异性结合会减少30%，但操作时间会多两分钟。而且加酶标液的时候要刚好没过板子，太多会流下来影响结果。算浓度要用标准曲线，比如吸光度1.0对应50μg/mL的话，测出2.0就要算成100μg/mL。