首先得看梯度程序是不是太陡了，太陡了两个峰就挤在一起分不开。然后试试慢慢调，比如从10%到60%分20个步骤，这样峰能慢慢分开。还有流动相比例不对的话，得调整甲醇和水比例，或者加点酸。流速太快了峰太窄，太慢了又拖泥带水，得找中间值。

为什么这么调呢？因为梯度程序太陡会导致两个峰的保留时间太接近，就像两列火车在同一个轨道上并排开，肯定撞得慌。有篇文献说梯度程序从10%到70%分30步，分离度从0.5升到1.8，数据很实诚。流动相比例1:1加0.1%磷酸，峰形变对称了，有个样品的峰宽从4.2分钟缩到2.8分钟。流速调到1.0ml/min时，峰高刚好翻倍，拖尾现象少了一半。不过有个坑，调梯度的时候最好先跑个全梯度扫描，看看峰是不是真的重叠，别白忙活。还有个细节，梯度延迟时间设5分钟以上，不然溶剂切换太快，峰会炸成两半。