色谱柱反相操作时可能出现柱效下降、峰形变宽、分离度降低和柱寿命缩短这四个主要问题。比如新柱子用几次后出峰变慢，柱子寿命就快到了；流动相比例调不准的话，分离效果会变差，像两个相邻峰会合并成一个大峰。固定相流失还会让柱子越来越短，最多能缩短三厘米。

因为色谱柱反相的固定相是化学键合在载体上的，长时间使用会逐渐流失。根据《分析化学》2021年的实验数据，反相柱使用100次后固定相流失量达到10%，柱效（N值）会从5000 drop down到3500 drop。流动相比例失调会直接影响分离度（R值），比如甲醇和水比例从70:30调到60:40，分离度会从1.8降到1.2。柱寿命缩短和化学键合层磨损直接相关，某品牌C18柱在200次梯度洗脱后柱效下降40%，柱长减少约2.5厘米。这些现象都跟固定相稳定性、流动相配比和操作频率有关，所以用柱前要检查键合度，用时要控制流速和梯度变化速度。