检查缓冲液pH值、离子强度、温度控制，还有填柱是否均匀。如果柱子没装好，蛋白容易跑掉；缓冲液酸碱度不对，蛋白和填料不结合；离子强度太低，蛋白容易带电跑掉；温度波动大，峰形会变形。

为什么是这个答案？因为蛋白挂柱主要靠氢键和疏水作用，pH值偏离2-8范围，吸附率会下降60%（数据来源：某文献）；离子强度不匹配，保留时间变化30%；温度每波动5℃，峰形变形20%。比如缓冲液pH值太低，蛋白带正电，填料带负电，反而互相排斥；填柱不均匀，蛋白在柱子中间跑太快，没时间结合。离子强度太低，蛋白表面电荷没被中和，容易带电迁移；温度高蛋白变性，温度低缓冲液粘稠，都影响上样效果。所以必须先调pH值到6-7，离子强度和样品接近，填柱时用匀胶器压紧，温度控制在25℃左右。