革兰氏染色第一步固定细菌用酒精脱色，接着结晶紫染色，碘液固定颜色，酒精再次脱色。关键在酒精脱色时间控制，太短细菌留紫色，太长就全脱色变红色。每步间隔不能超过两分钟，否则细菌会死亡失去活性。

为什么这样操作呢？酒精脱色能溶解脂质膜，让薄壁菌保留紫色，厚壁菌被脱掉颜色。有研究显示脱色时间误差超过5秒，假阳性率会涨到25%以上。结晶紫和碘液混合成复合物，只有薄壁菌的孔隙能渗入，就像给细菌穿防护服。酒精再洗一遍，洗不净的紫色说明细菌革兰氏阳性，洗掉的变红色就是阴性。这样分三步洗脱，既保证细菌存活又区分开两种类型。但有人会问酒精浓度多少合适？其实标准是95%乙醇，浓度低的话脱色不彻底，高了细菌会立即死亡。